As well as de douze milliards de doses de vaccins à ARNm ont été administrées dans le monde depuis le début de la pandémie de COVID, sauvant des millions de vies. Mais les thérapies basées sur l’ARN pour d’autres maladies se sont jusqu’à présent révélées furthermore difficiles à développer. La réponse immunitaire de tout le corps causée par les vaccins à ARNm est fantastique pour combattre les agents pathogènes envahisseurs, mais de nombreuses autres problems n’affectent qu’un seul organe ou form de cellule. Concevoir des molécules d’ARN pour n’activer leurs prices utiles thérapeutiques que lorsqu’elles se trouvent dans les bonnes conditions est la clé de la prochaine génération de thérapies « intelligentes » basées sur l’ARN.
Un nouveau système créé par des chercheurs du Wyss Institute de l’Université de Harvard et du MIT pourrait aider à libérer ce potentiel, comme le rapporte Mother nature Communications. L’équipe, travaillant dans le laboratoire de Jim Collins, Ph.D. membre de la Wyss Main Faculty, a développé un nouveau circuit de détection et de réponse d’ARN qu’ils appellent Détection et amplification des déclencheurs d’ARN by way of ADAR, ou DART VADAR. Tirant parti d’une enzyme qui modifie l’ARN dans le corps humain, DART VADAR permet aux chercheurs de concevoir facilement des circuits qui déclenchent la traduction d’une cost utile génétique délivrée en réponse à la présence d’un marqueur moléculaire spécifique de la maladie et/ou du form cellulaire. Cette capacité élargit la portée des situations qui peuvent être traitées avec des thérapies à foundation d’ARN et permet le développement de traitements hautement spécifiques pour une variété de maladies.
“Je suis particulièrement enthousiasmé par le fait que notre système DART VADAR est un circuit à foundation d’ARN compact et cliniquement pertinent qui permet de diriger des thérapies de manière hautement programmable vers des styles de cellules spécifiques et des cellules dans certains états, minimisant ainsi les effets hors cible. “, a déclaré Collins, qui est également professeur Termeer de génie médical et de sciences au MIT.
Du déclencheur à la traduction à la thérapie
Le Collins Lab s’intéresse depuis longtemps à la recherche de moyens de contrôler la traduction des ARN dans les cellules et a développé plusieurs méthodes, dont eToeholds, qui leur permettent d’initier la traduction uniquement en présence d’une molécule “déclencheuse” spécifique. Mais le processus de conception d’une nouvelle composition moléculaire pour chaque nouveau déclencheur était lourd et compliqué. “Notre technologie est née de l’idée que nous pouvions découpler les éléments des capteurs d’ARN réactifs – détection, activation, and so on. – il est donc beaucoup as well as facile de concevoir des circuits pour de nouvelles cibles. Idéalement, nous voulions pouvoir modifier la demand utile sans modifiant l’élément capteur à chaque fois », a déclaré le co-leading auteur Raphaël Gayet, Ph.D. chercheur à l’Institut Wyss.
La compound autour de laquelle DART VADAR est construit est appelée adénosine désaminases agissant sur l’ARN, ou ADAR. Les ADAR sont des enzymes qui se lient aux molécules d’ARN double brin (ARNdb) et effectuent une modification de base spécifique, convertissant une molécule d’adénosine (A) incompatible en inosine (I). Ce changement déstabilise la framework de l’ARNdb et on pense qu’il est impliqué dans les réponses des cellules à différents virus, dont beaucoup portent leur matériel génétique sous forme d’ARN.
Les chercheurs ont estimé qu’ils pourraient utiliser la capacité naturelle d’édition d’ARNdb des ADAR pour créer un nouveau variety de capteur d’ARN réactif. Ils ont donc conçu un circuit d’ARN very simple brin contenant plusieurs éléments modulaires :
- Une séquence complémentaire d’un ARN d’intérêt dans une cellule
- Une séquence de codon “cease” d’uracile-adénosine-guanine (UAG) au milieu du brin d’ARN
- Une séquence codant pour une protéine verte fluorescente en tant que molécule sign observable
La séquence de codons UAG empêche la traduction de tous les gènes codés après elle, comme la protéine fluorescente verte, vehicle UAG est le signal naturel envoyé à un ribosome pour qu’il arrête le processus de traduction et tombe d’un brin d’ARN. Cependant, si le circuit se lie à un brin d’ARN cible complémentaire dans la cellule, il devient une molécule d’ARN double brin. L’équipe a conçu son circuit de manière à ce que le A de la séquence UAG « ne corresponde pas » à une cytosine (C) dans le brin cible, plutôt qu’à son partenaire légitime de U. Ce décalage libère essentiellement le A à trouver et à convertir en I par ADAR, et la séquence UIG résultante n’est plus un codon “prevent”, permettant à la traduction de se produire. Ainsi, la protéine fluorescente verte est produite, signalant que le circuit du capteur a trouvé et lié à sa cible.
Les ADAR se trouvent naturellement à des concentrations élevées dans les neurones, mais en faibles quantités dans d’autres cellules, et l’équipe a découvert que même si leur capteur à foundation d’ADAR fonctionnait, son activité était faible. Pour s’assurer que le capteur puisse fonctionner dans différents sorts de cellules, ils ont ajouté la séquence du gène ADAR à leurs capteurs. Désormais, l’activation du capteur par ADAR naturellement présent dans une cellule pourrait stimuler la output de additionally d’ADAR, créant une boucle de rétroaction favourable qui amplifie l’activité du capteur. Ils ont vérifié que cela se produisait dans des expériences in vitro, en observant que les cellules qui avaient reçu le capteur DART VADAR contenant ADAR affichaient une augmentation marquée des niveaux de protéines vertes fluorescentes.
“Ce qui est vraiment excitant avec ce capteur, c’est que la séquence signal de la protéine verte peut être facilement remplacée par la séquence de n’importe quel gène thérapeutique que vous souhaitez exprimer en réponse à la présence d’un ARN déclencheur dans la cellule. Ainsi, non seulement ce capteur détecte cibles, il peut y répondre automatiquement sans nécessiter l’intervention de l’utilisateur, automatisant la livraison d’une charge utile thérapeutique au niveau cellulaire », a déclaré le co-premier auteur Shiva Razavi, Ph.D. boursier postdoctoral au MIT.
Un capteur très smart
Alors que l’équipe était ravie que sa première variation de DART VADAR fonctionne, elle a réalisé qu’elle devrait apporter quelques modifications si elle devait être utile en tant qu’approche thérapeutique.
“Alors que l’expression de l’ADAR naturel by using notre capteur a augmenté le taux d’édition A-to-I d’environ 3 % à approximativement 30 %, cela n’est toujours pas utile dans un contexte réel. L’ADAR endogène est insuffisant pour générer des résultats cohérents et trop grand pour tenir dans des véhicules de livraison cliniquement approuvés, comme AAV [adeno-associated virus]. En termes de potentiel de traduction, il est vital de s’assurer que tout ce que vous faites dans le laboratoire peut de manière réaliste en faire un produit un jour », a déclaré la co-première auteur Katherine Ilia, Ph.D. chercheuse postdoctorale au MIT.
Pour répondre à ces limites, l’équipe a tiré parti d’une variante ADAR conçue qui a été tronquée pour ne contenir que sa région active d’édition d’ARN, et a ajouté deux courtes régions qui peuvent se lier à une composition d’ARN « en épingle à cheveux » connue sous le nom de MS2, qu’ils ont insérée dans leur capteur. séquence flanquant le codon UAG. Cette protéine chimère, qu’ils ont nommée MCP-ADAR, est beaucoup in addition petite que l’ADAR naturelle et a une probabilité réduite de se lier à des molécules non ciblées. Ils ont également modifié le gène ADAR dans leur capteur d’ARN afin qu’il soit traduit dans leur variation MCP-ADAR modifiée. Désormais, lorsqu’un capteur était activé par un ADAR naturel dans une cellule, le MCP-ADAR produit pouvait se lier à d’autres capteurs by using les épingles à cheveux MS2, entraînant la production de furthermore de MCP-ADAR et amplifiant l’activité des capteurs.
Pour tester les performances de leur système DART VADAR optimisé avec son enzyme d’ingénierie, l’équipe a décidé de voir s’il pouvait détecter une mutation à foundation one of a kind dans la tumeur humaine p53
gène suppresseur connu pour entraîner plusieurs forms de most cancers. Ils ont conçu un capteur DART VADAR pour détecter le mutant p53 et l’ont introduit dans une lignée de cellules humaines avec des plasmides exprimant la edition normale ou mutante du gène. Ils ont découvert que les cellules contenant la edition mutante du gène montraient également une activation quintuple du gène rapporteur dans le capteur, montrant que le capteur enregistrait effectivement la présence de la séquence génétique aberrante avec une spécificité élevée.
Ils ont ensuite testé si DART VADAR pouvait distinguer les cellules saines qui se trouvent à différents stades de développement, sur la foundation de la présence de marqueurs moléculaires spécifiques de l’état cellulaire. Ils ont utilisé des cellules de souris appelées myoblastes, qui sont des cellules progénitrices capables de se différencier en plusieurs varieties de cellules, notamment les myotubes (qui deviennent des muscle mass) et les ostéoblastes (qui produisent de l’os). Ils ont conçu des capteurs DART VADAR pour détecter les marqueurs ARN des deux destins cellulaires, ont poussé les myoblastes à se différencier, puis ont ajouté leurs capteurs aux cellules. Ils ont découvert que les deux capteurs produisaient fortement leurs molécules de sign de charge utile respectives dans leurs cellules correspondantes, démontrant que les capteurs peuvent détecter des différences moléculaires dans les états cellulaires et les types de cellules.
L’équipe souligne qu’afin d’appliquer DART VADAR à diverses purposes cliniques, des features supplémentaires du web-site cible, tels que la probabilité de déclencher une réponse immunitaire, devront être pris en compte lors du processus de développement du capteur. Ils prévoient que les avancées informatiques récentes dans la prédiction de la composition des protéines pourraient être utilisées pour affiner davantage la sélection des sites cibles optimaux afin de guider la conception de capteurs DART VADAR sûrs et efficaces. Ils ont demandé une subvention pour utiliser DART VADAR afin d’explorer la différenciation progressive des cellules souches en d’autres forms de cellules, qui pourraient à l’avenir être utilisées pour remplacer les cellules malades chez un affected person par des cellules saines.
“La capacité de cette équipe à combiner des composants biologiques préexistants dans une toute nouvelle technologie d’ingénierie qui a le potentiel de rendre le traitement d’un big éventail de maladies additionally rapide et in addition facile est un fantastic exemple de la façon dont la biologie synthétique peut changer le monde pour le mieux”, a déclaré Directeur fondateur de Wyss Don Ingber, MD, Ph.D. Ingber est également professeur Judah Folkman de biologie vasculaire à la Harvard Health care Faculty et au Boston Children’s Medical center, et professeur Hansjörg Wyss d’ingénierie bioinspirée à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Utilized Sciences.
Nathaniel Tippens est un autre co-leading auteur de l’article. Parmi les autres auteurs figurent Makoto Lalwani, Kehan Zhang et Jack Chen du Wyss Institute et du MIT, Jonathan Chen du MIT et du Wide Institute, et Jose Vargas-Asencio du MIT Picower Institute. Ce travail a été soutenu par les subventions NIH R01EB024591 et 5RC2DK120535-03, et le Wyss Institute for Biologically Encouraged Engineering.