Les tissus ont été collectés lors d’autopsies réalisées au Massachusetts General Hospital entre janvier 2021 et février 2022. Les tissus collectés étaient des ganglions lymphatiques axillaires bilatéraux, des ganglions lymphatiques médiastinaux, du foie, de la rate, du ventricule gauche cardiaque et du ventricule droit cardiaque. Comme l’emplacement du site d’injection de la vaccination n’était généralement pas connu, les ganglions lymphatiques axillaires ont été échantillonnés et analysés bilatéralement dans tous les cas.
Les critères d’inclusion étaient la capacité de prélever des tissus frais, des antécédents clairs de vaccination ou d’absence de vaccination et un intervalle post-mortem ≤ 60 h. Les patients ayant des antécédents d’infection par le SRAS-CoV-2 ont été exclus du groupe vacciné et du groupe témoin non vacciné. Le tissu cardiaque de patients mourant du SRAS-CoV-2 a été utilisé comme contrôle positif pour la PCR du SRAS-CoV-2.
L’étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel des sujets humains de l’hôpital (Mass General Brigham IRB). La CISR a renoncé à l’exigence du consentement du patient et le consentement du patient n’a pas été obtenu.
Extraction d’ARN
Environ 2 g de tissu ont été placés dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) et conservés à -80 ° C.
Tous les échantillons ont été décongelés à température ambiante dans le réactif TRIzol pendant 10 minutes pour stériliser tout échantillon infecté par le SRAS-CoV-2. À l’aide d’un homogénéisateur Hitachi HVC20 (Kinematica AG, Suisse), les tissus ont été lysés sur de la glace pendant 5 secondes à grande vitesse, suivis de plus de 10 secondes au repos.
L’ARN a été extrait de l’homogénat TRIzol selon le protocole du fabricant.
En bref, 200 µL de chloroforme ont été ajoutés par 1 ml d’échantillon de TRIzol et vortexés à grande vitesse pendant 15 s, puis incubés à température ambiante pendant 3 min. Le volume de chloroforme a été augmenté de 2 fois pour les échantillons présentant une teneur tissulaire visiblement élevée. Après incubation, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 g pendant 15 min à 4 °C.
L’ARN séparé en phases a été transféré dans un tube propre de 1,5 ml auquel 500 µL de 2-propanol et 4 µL de glycogène ont été ajoutés et mélangés par pipetage doux, suivi d’une incubation de 10 minutes à température ambiante. Les échantillons ont été centrifugés à 12 000 g pendant 10 min à 4 °C. Le surnageant a été aspiré et l’ARN granulé a été lavé 1 à 2 fois avec de l’éthanol à 75 % (v/v) et centrifugé à 7 500 g pendant 5 min à 4 °C.
Après l’aspiration finale, les pastilles d’ARN ont été brièvement séchées à l’air, remises en suspension avec 100 à 400 µL d’eau sans endonucléase et placées dans un bloc chauffant à 55 ° C pendant environ 1 min.
Évaluation de la qualité de l’ARN
Le rendement de chaque échantillon d’ARN extrait a été déterminé à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Le ratio 280/260 était un premier indicateur de la pureté de chaque échantillon.
Un protocole sans EDTA du Joint Genome Institute (JGI)25 a été appliqué pour tous les traitements à la DNase à l’aide du kit RN easy (Qiagen, Louisville, KY) et de 2U d’enzyme DNAse I (New England Biolabs, Ipswich, MA). Des tests RT-qPCR en deux étapes des gènes domestiques, avec ou sans la transcriptase inverse (-RT), ont été réalisés pour confirmer davantage le rendement en ARN de qualité. Le mélange avec RT contenait 0,5 à 1 µg d’ARN total, des amorces aléatoires (Promega), l’amorce Oligo (dT) 15 (Promega, Madison, WI) et la transcriptase inverse Superscript III (Invitrogen).
En triple, un échantillon d’ADNc de 2 µL (10 ng) a été ajouté à un volume de 20 µL contenant SYBR Green Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA) et 300 nM de chaque amorce (IDT DNA, Coralville, IA, voir le tableau supplémentaire 5. ). Les réglages de thermocyclage étaient de 10 min à 95 °C d’activation de l’ADN polymérase, suivis de 40 cycles avec 20 s à 95 °C, 20 s à 60 °C et 15 s à 72 °C.
Les valeurs d’amplification Ct et les tracés de courbe de fusion des échantillons d’ADNc de foie d’ACTB et de rate d’ACTB (10 ng) ont été comparés à leurs échantillons -RT (également 10 ng) en parallèle. Tous les autres ADNc de tissus ont été comparés aux contrôles -RT pour l’amplification du gène GAPDH. L’ARN extrait utilisé pour les expériences RT-qPCR de détection de vaccins avait un ADNc avec des valeurs Ct de 7 cycles ou plus que les mélanges parallèles -RT.
Test RT-qPCR pour la détection des vaccins à ARNm
La cible finalisée du test RT-qPCR pour la séquence d’ARNm de BNT162b2 s’aligne dans la majeure partie du domaine de l’hélice centrale (CH), alors que pour l’ARNm-1273, elle se situe dans le domaine heptad-repeat-2 (HR2) (Fig. 1a). Pour les contrôles positifs au vaccin, des fragments d’ADN double brin (ADNdb) des séquences du vaccin BNT162b2 et ARNm-1273 ont été achetés auprès d’Integrated DNA Technologies (Coralville, IA).
Les séquences gBlockTM ont été sélectionnées pour inclure ou être proches des deux substitutions Proline des deux vaccins conçues pour aider à stabiliser la protéine de pointe (Fig. 2 supplémentaire)26,27. Pour la détection de BNT162b2, les amorces ont été conçues à l’aide de Primer3Plus et testées avec le test SYBR Green sur des fragments d’ADNdb et des puits d’échantillons de contrôle sans modèle (NTC).
L’analyse de la courbe de fusion a été utilisée pour déterminer le meilleur ensemble d’amorces. Les concentrations d’amorces optimisées sont répertoriées dans le tableau 2. Pour la détection du vaccin ARNm-1273, trois ensembles d’amorces ont été testés en utilisant des dilutions en série contre une sonde TaqMan localisée et l’ensemble final a été sélectionné pour le score d’efficacité optimal des amorces.
L’efficacité des amorces des ensembles finaux d’amorces/sondes BNT162b2 et ARNm-1273 était respectivement de 97,7 % et 97,2 % (Figure 3 supplémentaire). Après correction du matériel d’ADNdb dans les courbes d’étalonnage en vaccin à ARNsb (c’est-à-dire multiplié par 2), la limite de détection (LOD) pour BNT162b2 était de 6 copies d’ARNsb/réaction et la LOD pour l’ARNm-1273 était de 11 copies d’ARNsb/réaction.
Tableau 2 Ensembles d’amorces/sondes de détection de vaccins RT-qPCR.
Des échantillons d’ARN de 2 µL (100 ng au total) ont été ajoutés à un volume final de 20 µL de mélange réactionnel contenant 5 µL de Master Mix en 1 étape de TaqMan Fast Virus (Life Technologies, Carlsbad, CA) en triple. Le thermocyclage a été effectué à 50 ° C pendant 10 minutes pour la transcription inverse, suivi de 20 secondes à 95 ° C, puis de 45 cycles à 95 ° C pendant 5 secondes et à 60 ° C pendant 30 secondes. Tous les tests comprenaient des fragments de séquence de vaccin d’ADNdb (contrôles positifs) et des puits NTC (contrôles négatifs).
Cinq autopsies non vaccinées ont été testées avec chaque test de vaccin comme contrôle supplémentaire. Les critères de détection du vaccin dans les tests exigeaient que les échantillons aient une valeur Ct inférieure à 35 cycles dans les trois puits testés. À titre de contrôle supplémentaire, un test de détection du SRAS-CoV-2 pour le gène E a été administré28.
En bref, la même concentration d’ARN de 100 ng a été combinée avec le Master Mix en 1 étape de TaqMan Fast Virus avec les amorces et la sonde E Sarbeco (IDT DNA, Coralville, IA, voir le tableau supplémentaire 5). L’incubation pour la transcription inverse a été réalisée à 50 °C pendant 10 min, suivie de 95 °C pendant 20 s, de 45 cycles à 95 °C pendant 3 s et à 58 °C pendant 30 s. Tous les tests basés sur la fluorescence ont été effectués sur un QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific).
Validation des échantillons positifs au vaccin
Pour valider les échantillons positifs pour BNT162b2 ou ARNm-1273 issus des tests RT-qPCR, leurs produits d’ADNc ont été utilisés dans 1 à 3 réactions PCR possibles pour cibler des zones en dehors de la séquence de contrôle positif (fragment d’ADNdb). Le tableau 3 répertorie les jeux d’amorces, l’emplacement dans la séquence du vaccin et la longueur de l’amplicon. En bref, les réactions PCR ont été réalisées avec 25 µL de mélange réactionnel composé de 50 à 100 ng d’ADNc d’échantillon, de 1 à 1,25 µM de chaque amorce et de 12,5 µL de GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI) en suivant les instructions du fabricant.
Les réactions comprenaient 40 à 43 cycles d’amplification de 30 s de dénaturation à 95 ° C, 60 s d’hybridation à 60 ° C et un temps d’élongation dépendant de la longueur de la pb à 72 ° C (30 s pour 500 pb). Les produits de PCR ont été résolus sur un gel d’agarose à 1,5% coloré avec la coloration sur gel d’ADN sécurisé SYBR ™ (Thermo Fisher Scientific). Les bandes de longueur de pb cible ont été excisées et purifiées avec le kit d’extraction de gel QIAquick ® (Qiagen, Louisville, KY) et séquencées par Genewiz (Cambridge, MA) et analysées avec BLASTn pour l’alignement de la séquence avec la séquence du vaccin29.
Tableau 3 Ensembles d’amorces de validation.
Évaluation du moment d’apparition de la lésion myocardique
L’âge de guérison des lésions myocardiques dans les échantillons a été estimé à l’aide de caractéristiques pathologiques standards : nécrose myocardique avec de faibles quantités de neutrophiles (jours 1 à 2), de grandes quantités de neutrophiles (jours 3 à 5), infiltration de macrophages et élimination des myocytes (jours 4 à 5). 14), tissu de granulation lâche (jours 14 à 21), tissu de granulation collagène tardif (jours 21 à 28) et formation de cicatrices denses (plus de 28 jours)30,31.
Immunohistochimie
Des coupes de tissus provenant de tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont été montées sur des lames de verre chargées positivement. La déparaffinisation et la réhydratation des coupes ont été réalisées en traitant les lames avec des solutions de xylène (2 traitements de 5 minutes chacun) et d’éthanol gradué (100, 90, 70, 50 % et eau), respectivement. Après la réhydratation, la récupération de l’antigène a été réalisée par la méthode de récupération d’épitopes induite par la chaleur (HIER) en utilisant une solution de récupération d’antigène à faible pH (Biocare Medical, Reveal Decloaker, Pacheco, CA) dans une cocotte minute pendant 3 min.
Les lames ont ensuite été lentement refroidies et rincées à l’eau. Les peroxydases endogènes et les phosphatases alcalines ont été bloquées en traitant des coupes avec BLOXALL® (Vector Laboratories, Burlingame, CA) pendant 20 à 30 minutes, suivi de deux lavages dans une solution saline tamponnée au Tris avec un tampon Tween (TBST). Les lames ont ensuite été incubées avec 2,5 % de sérum de cheval normal (Vector Laboratories) pour bloquer la liaison non spécifique.
Pour détecter le marqueur macrophage CD68, des coupes de tissus ont été incubées pendant la nuit avec un anticorps monoclonal de souris (anticorps monoclonal anti-CD68, clone KP1, eBioscienceTM, Life Technologies, Carlsbad, CA) à une dilution de 1/250 à 40 °C. Les anticorps primaires ont été détectés en traitant des lames avec un réactif de détection secondaire commercial (Kit polymère ImmPRESS® HRP Horse Anti-Mouse IgG PLUS, Peroxydase, Vector Laboratories, Burlingame, CA) pendant 20 minutes, suivi d’un lavage avec une solution de lavage TBST. Enfin, les antigènes ont été détectés avec un substrat brun de peroxydase de raifort (HRP) (kit de substrat ImmPACT® DAB, Peroxydase, Vector Laboratories) en incubant des lames expérimentales pendant 1 min.
La contre-coloration a été réalisée avec de l’hématoxyline de Meyer et les lames ont été déshydratées par un traitement progressif à l’alcool (respectivement 50, 70, 90 et 100 %) suivi d’une élimination de l’alcool avec deux traitements au xylène (3 min chacun). Les lamelles permanentes ont été montées à l’aide du milieu de montage Cytoseal ™ XYL (milieu de montage Richard-Allan Scientific® Cytoseal ™ XYL, Thermo Scientific, Waltham, MA). Les macrophages ont été comptés manuellement dans les dix champs de puissance élevée (HPF) 400x contenant le plus de macrophages à l’aide d’un microscope Olympus BX53 et exprimés en nombre moyen de macrophages par HPF.
phosphatase alcaline, Vector Laboratories, Burlingame, CA) pendant 20 minutes, suivi d’un lavage avec une solution TBST. Les antigènes ont été détectés avec un substrat de phosphatase alcaline rouge (Vector Laboratories) en incubant des lames expérimentales pendant 1 min.
analyses statistiques
Les groupes ont été comparés à l’aide du test t, du test exact de Fisher ou du test du chi carré, selon le cas. Le logiciel de conception et d’analyse Quantstudio™ v1.52 a été utilisé pour les graphiques d’amplification et l’analyse des tracés de courbes de fusion.
Tous les autres graphiques et analyses ont été réalisés à l’aide du logiciel GraphPad Prism 9 (GraphPad Prism Software, San Diego, CA). Les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux.
Résumé du rapport
De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé du rapport sur la recherche sur la nature lié à cet article.
