La sclérose latérale amyotrophique (SLA), communément appelée maladie de Lou Gehrig et maladie de Stephen Hawking, est une maladie neurodégénérative qui entraîne la perte progressive du contrôle des muscle tissues du corps. Il est actuellement incurable et la result in de la maladie est inconnue dans additionally de 90% de tous les cas, bien que l’on pense que des facteurs génétiques et environnementaux sont impliqués.
Les groupes de recherche du Dr Akira Kitamura de la Faculté des sciences de la vie avancées de l’Université d’Hokkaido et du professeur Jerker Widengren du KTH Royal Institute of Technological know-how, en Suède, ont mis au position une nouvelle system able de détecter une framework caractéristique de l’ARN dans temps réel dans des cellules vivantes. La method, basée sur la spectroscopie microscopique à fluorescence, a été publiée dans la revue Nucleic Acids Study.
“L’un des facteurs génétiques qui serait impliqué dans le développement de la SLA est une séquence spécifique d’ARN qui forme une framework à quatre brins, appelée G-quadruplex”, explique Kitamura, leading auteur de l’étude. “Normalement, ces constructions régulent l’expression des gènes. Cependant, une mutation du chromosome 9 chez l’homme entraîne la formation de quadruplexes G qui peuvent jouer un rôle dans les maladies neurodégénératives, y compris la SLA.”
L’un des moreover grands hurdles à la compréhension du rôle specific des quadruplexes G dans la maladie a été les limites de l’étude de leur development et de leur emplacement dans les cellules vivantes en temps réel. Les groupes Kitamura et Widengren ont réussi à développer une method very simple, robuste et largement applicable qui résout les problèmes existants.
La strategy match un colorant cyanine appelé Alexa Fluor 647 (AF647). Lorsqu’il est marqué à l’ARN, l’état de clignotement de fluorescence du colorant est modifié avec la formation des quadruplexes G d’ARN. Les groupes ont analysé l’ARN marqué à l’AF647 à l’aide d’une system de microscopie appelée surveillance TRAST (TRAnsient Condition) pour détecter ce clignotement de fluorescence en temps réel.
“Visuellement, les changements résolus dans le temps de l’intensité de la fluorescence apparaissent comme des clignotements”, a déclaré Kitamura, décrivant la strategy. “Dans TRAST, nous exposons les cellules à un schéma spécifique d’intensités lumineuses changeantes et mesurons l’intensité moyenne de la fluorescence émise par le colorant lié à l’ARN dans les cellules sur des intervalles de temps spécifiques. En mesurant les changements dans les propriétés de clignotement, nous pouvons distinguer les buildings de ARN dans la cellule.”
L’équipe a calibré son expérience dans des ailments de laboratoire, déterminant exactement quel clignotement de fluorescence correspondait aux G-quadruplexes d’ARN. À partir de ces données, ils ont pu déterminer l’emplacement des quadruplexes G d’ARN dans les cellules vivantes à l’aide de TRAST.
Ce travail prouve que les colorants cyanine peuvent fournir des paramètres de lecture sensibles sur les états de repliement des G-quadruplexes d’ARN dans les cellules vivantes, et même pour les cellules individuelles. Ceci, à son tour, permet d’étudier les quadruplexes G d’ARN dans la maladie en temps réel au niveau intracellulaire. Il peut également être appliqué pour étudier le repliement et le mauvais repliement des protéines dans les cellules.