Des scientifiques dirigés par le lauréat du prix Nobel Stefan Hell à l’Institut Max Planck pour la recherche médicale à Heidelberg ont développé un microscope à tremendous-résolution avec une précision spatio-temporelle d’un nanomètre par milliseconde. Une variation améliorée de leur microscopie à super-résolution MINFLUX récemment introduite a permis d’observer de minuscules mouvements de protéines uniques à un niveau de détail sans précédent : le mouvement pas à pas de la protéine motrice kinésine-1 lorsqu’elle marche le extensive des microtubules tout en consommant de l’ATP. Les travaux mettent en évidence la puissance de MINFLUX en tant que nouvel outil révolutionnaire pour observer les changements conformationnels de taille nanométrique dans les protéines.
Pour démêler le fonctionnement interne d’une cellule, il faut connaître la biochimie des protéines individuelles. Mesurer de minuscules changements dans leur placement et leur forme est le défi central ici. La microscopie à fluorescence, en particulier la microscopie à super-résolution (c’est-à-dire la nanoscopie) est devenue indispensable dans ce domaine émergent. MINFLUX, le système de nanoscopie à fluorescence récemment introduit, a déjà atteint une résolution spatiale de un à quelques nanomètres : la taille de petites molécules organiques. Mais faire passer notre compréhension de la physiologie moléculaire des cellules à un niveau supérieur nécessite des observations à une résolution spatio-temporelle encore as well as élevée.
Lorsque le groupe de Stefan Hell a présenté MINFLUX pour la première fois en 2016, il avait été utilisé pour suivre les protéines marquées par fluorescence dans les cellules. Cependant, ces mouvements étaient aléatoires, et le suivi avait des précisions de l’ordre de la dizaine de nanomètres. Leur étude est la première à appliquer le pouvoir de résolution de MINFLUX aux changements conformationnels des protéines, en particulier la protéine motrice kinésine-1. Pour ce faire, les chercheurs de l’Institut Max Planck pour la recherche médicale ont développé une nouvelle version de MINFLUX pour le suivi de molécules fluorescentes uniques.
Toutes les méthodes établies pour mesurer la dynamique des protéines ont de sérieuses limites, ce qui entrave leur capacité à traiter la plage (sous) nanométrique / (sous) milliseconde d’importance critique. Certains offrent une résolution spatiale élevée, jusqu’à quelques nanomètres, mais ne peuvent pas suivre les changements assez rapidement. D’autres ont une résolution temporelle élevée mais nécessitent un marquage avec des billes de 2 à 3 ordres de grandeur as well as grandes que la protéine étudiée. Étant donné que le fonctionnement de la protéine est susceptible d’être compromis par une bille de cette taille, les études utilisant des billes laissent des questions ouvertes.
Fluorescence d’une seule molécule
MINFLUX, cependant, ne nécessite qu’une molécule de fluorescence typical de 1 nm comme étiquette attachée à la protéine, et peut donc fournir à la fois la résolution et l’invasivité minimale nécessaires à l’étude de la dynamique des protéines natives. “L’un des défis consiste à construire un microscope MINFLUX qui fonctionne près de la limite théorique et qui soit protégé contre le bruit ambiant”, explique Otto Wolff, doctorant dans le groupe. “Concevoir des sondes qui n’affectent pas la fonction des protéines, mais qui révèlent tout de même le mécanisme biologique, en est une autre”, ajoute son collègue Lukas Scheiderer.
Le microscope MINFLUX que les chercheurs présentent maintenant peut enregistrer les mouvements des protéines avec une précision spatio-temporelle allant jusqu’à 1,7 nanomètre par milliseconde. Elle nécessite la détection d’une vingtaine de photons seulement émis par la molécule fluorescente. “Je pense que nous ouvrons un nouveau chapitre dans l’étude de la dynamique des protéines individuelles et de la façon dont elles changent de forme au cours de leur fonctionnement”, déclare Stefan Hell. “La combinaison de haute résolution spatiale et temporelle fournie par MINFLUX permettra aux chercheurs d’étudier les biomolécules comme jamais auparavant.”
Résoudre le mouvement de pas de la kinésine-1 avec de l’ATP dans des conditions physiologiques
La kinésine-1 est un acteur clé du transportation de marchandises dans nos cellules, et les mutations de la protéine sont au cœur de plusieurs maladies. La kinésine-1 « marche » en fait le prolonged des filaments (les microtubules) qui traversent nos cellules comme un réseau de rues. On peut imaginer que le mouvement est littéralement un « pas à pas », puisque la protéine a deux « têtes » qui changent alternativement de place sur le microtubule. Ce mouvement se produit généralement le long de l’un des 13 protofilaments formant le microtubule et est alimenté par la division du principal fournisseur d’énergie de la cellule, l’ATP (adénosine triphosphate).
En utilisant un seul fluorophore pour marquer la kinésine-1, les scientifiques ont enregistré les 16 nm réguliers. étapes de têtes individuelles ainsi que des sous-étapes de 8 nm, avec une résolution spatio-temporelle nanométrique/milliseconde. Leurs résultats ont prouvé que l’ATP est absorbé lorsqu’une seule tête est liée au microtubule, mais que l’hydrolyse de l’ATP se produit lorsque les deux têtes sont liées. Il a également révélé que le pas à pas implique une rotation de la «tige» de la protéine, la partie de la molécule de kinésine qui contient la cargaison. La résolution spatio-temporelle de MINFLUX a également révélé une rotation de la tête dans la stage initiale de chaque pas. De manière significative, ces découvertes ont été faites en utilisant des concentrations physiologiques d’ATP, ce qui n’était pas doable jusqu’à présent avec de minuscules marqueurs fluorescents.
Potentiel futur dans l’exploration de la dynamique des protéines
“Je suis ravie, alors voyez où MINFLUX nous emmènera. Cela ajoute une autre dimension à l’étude du fonctionnement des protéines. Cela peut nous aider à comprendre les mécanismes derrière de nombreuses maladies et, en fin de compte, contribuer au développement de thérapies”, ajoute Jessica Matthias, un scientifique postdoctoral anciennement dans le groupe Hell’s qui investigate maintenant les programs du MINFLUX à une variété de thoughts biologiques.